Της Αλεξάνδρας Μαρκεζίνη,
Η γονιμότητα στις γυναίκες είναι άμεσα συνυφασμένη με τον χρόνο, καθώς με το πέρας του χρόνου συσσωρεύονται όλο και περισσότερες αλλοιώσεις στο γενετικό υλικό. Σήμερα, πιο πολύ από ποτέ, που ένα μεγάλο ποσοστό των γυναικών τεκνοποιεί σε μεγάλη ηλικία, ο κίνδυνος υπογονιμότητας αυξάνεται. Έτσι, απαραίτητο εργαλείο κρίνεται η κρυοβιολογία, που ήρθε να προτείνει την κρυοσυντήρηση ωαρίων και ωοθηκικού ιστού, ως μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική.
Η κρυοσυντήρηση ωαρίων και ωοθηκικού ιστού πραγματοποιείται σε γυναίκες νεαρής ηλικίας (ιδανικό εύρος 20-30 ετών), καθώς τότε το βιολογικό υλικό που λαμβάνεται είναι μεγαλύτερης ποιότητας και διενεργάται τόσο για κοινωνικούς λόγους όσο και σε περιπτώσεις που το επιβάλλει το παθοφυσιολογικό προφίλ της γυναίκας. Για παράδειγμα, σε περίπτωση κάποιας χειρουργικής επέμβασης ή αντικαρκινικής θεραπείας, η κρυοσυντήρηση κρίνεται αναγκαία για τη διατήρηση της γονιμότητας της ασθενούς. Στην αντικαρκινική θεραπεία με χημειοθεραπεία προτιμάται η κρυοσυντήρηση ωοθηκικού ιστού, καθώς ατροφούν τα ωοθυλάκια και η ασθενής οδηγείται σε πρόωρη ανεπάρκεια των ωοθηκών.
Η πρώτη φάση της διαδικασίας θυμίζει τα βήματα που ακολουθούνται για μια εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF). Και στις δύο περιπτώσεις, πρώτα διενεργείται διέγερση των ωοθηκών, χορηγώντας ορμόνες (γοναδοτροπίνες) με στόχο την παραγωγή μεγάλου αριθμού ωαρίων αντί του ενός που παράγεται σε φυσιολογικές συνθήκες μηνιαία. Πάντα δίνεται προσοχή στην αποφυγή υπερδιέγερσης των ωοθηκών. Μετά από 2 περίπου εβδομάδες γίνεται λήψη των ωαρίων από τα ωοθυλάκια με διακολπική αναρρόφηση με υπερήχους. Πρακτικά, ένας ανιχνευτής εισέρχεται στον κόλπο της γυναίκας για την ταυτοποίηση των ωοθυλακίων και έπειτα μια βελόνα, η οποία έχει προσαρτημένη πάνω της συσκευή αναρρόφησης, εισέρχεται στον κόλπο και συλλέγει τα ωάρια. Τα ωάρια, υφιστάμενα κατάλληλη επεξεργασία, καταψύχονται σε τέτοιες θερμοκρασία ώστε να ανασταλεί κάθε λειτουργία τους μέχρι να αποψυχθούν.
Κάθε κύτταρο περιέχει σε μεγάλο ποσοστό νερό. Ως γνωστόν, το νερό υπό κατάλληλες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας παγώνει και μετατρέπεται από την υγρή στη στερεή του φάση. Αυτό σε κυτταρικό πλαίσιο μπορεί να είναι αρκετά δυσμενές, καθώς η παρουσία κρυστάλλων πάγου στο εσωτερικό του κυττάρου εξαναγκάζει το κύτταρο να χάσει τη λειτουργικότητά του. Για την αντιστάθμιση του φαινομένου αυτού, τα ωάρια αφυδατώνονται και επεξεργάζονται με κρυοπροστατευτικά .
Τα κρυοπροστατευτικά (CPAs) είναι ουσίες που χρησιμοποιούνται κατά την επεξεργασία των ωαρίων για κρυοσυντήρηση. Ρόλος τους είναι η διατήρηση της λειτουργικότητας, η μείωση μηχανικής βλάβης και καταπόνησης από κρυστάλλους πάγου και η μείωση του ωσμωτικού σοκ του κυττάρου, επιτρέποντας την επιβίωση μεγαλύτερου αριθμού κυττάρων προς μελλοντική απόψυξη και αξιοποίηση. Τα κρυοπροστατευτικά επιτρέπουν την αποθήκευση του βιολογικού ιστού σε υγρό άζωτο, αγγίζοντας μέχρι και τους -196οC.
Για την αποφυγή ενδοκυτταρικού πάγου, το κύτταρο αφυδατώνεται παρουσία κρυοπροστατευτικών. Σε πρώτη φάση το κύτταρο, αφού αφαιρείται νερό από το εσωτερικό του, συρρικνώνεται και ο χώρος όπου προϋπήρχε νερό τώρα πληρώνεται με το κρυοπροστατευτικό, αποκαθιστώντας το αρχικό μέγεθος του κυττάρου.
Σε υψηλές συγκεντρώσεις, ένα κρυοπροστατευτικό μπορεί να είναι αρκετά βλαβερό. Όμως, η προσθήκη του σε χαμηλή συγκέντρωση μπορεί να μην είναι τόσο αποδοτική. Έτσι, χρησιμοποιούνται αρκετά κρυοπροστατευτικά κάθε φορά, μερικά από τα οποία διεισδύουν στο εσωτερικό το κυττάρου (γλυκερόλη, DMSO) και μερικά που δεν διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη, όπως τα σάκχαρα και ορισμένες πρωτεΐνες, καθώς βοηθούν στη ελεγχόμενη αφυδάτωση. Δεδομένης της χαμηλής τοξικότητάς τους και της ικανότητάς τους να αλληλεπιδρούν με το νερό, μειώνουν τη θερμοκρασία πήξης του στο εσωτερικό του κυττάρου, με αποτέλεσμα την αποφυγή ενδοκυτταρικού πάγου.
Γιατί ο πάγος είναι τόσο σημαντικός ανασταλτικός παράγοντας;
Το κλειδί είναι η διατήρηση της ισορροπίας. Κάθε κύτταρο αποτελείται από μια εξωτερική μεμβράνη που περικλείει το κυτταρόπλασμα (μια ζελατινώδη μάζα), στην οποία υπάρχουν τα διάφορα οργανίδια. Στο κυτταρόπλασμα, το οποίο αποτελείται ως επί το πλείστων από νερό, «κολυμπούν» διάφορες ουσίες. Αν σχηματιστεί πάγος, τότε μειώνεται η διαθέσιμη συγκέντρωση νερού κι έτσι αυξάνεται η συγκέντρωση των ουσιών αυτών, κάτι το οποίο ενδέχεται να είναι τοξικό για το κύτταρο, καθώς πλέον δεν βρίσκονται οι ουσίες αυτές σε αραιωμένη κατάσταση.
Επίσης, ο σχηματισμός πάγου εν δυνάμει προκαλεί μηχανική βλάβη, ειδικά όταν σχηματίζεται εξωκυτταρικά, καθώς μπορεί να επιφέρει σύνθλιψη του κυττάρου. Ακόμα και στην περίπτωση του ενδοκυτταρικού πάγου, οι επιδράσεις είναι καταστροφικές για τη βιωσιμότητα και λειτουργικότητα του κυττάρου. Μέχρι στιγμής, είναι εγκεκριμένοι δύο τρόποι κρυοσυντήρησης, ή πιο απλουστευμένα κατάψυξης ωαρίων. Σε κάθε περίπτωση, το πρωτόκολλο που ακολουθείται πρέπει να είναι αυστηρά ελεγμένο, για να αποφευχθεί ο σχηματισμός κενοτοπιασμένων ωαρίων, δηλαδή ο σχηματισμός κυστιδίων εντός του κυττάρου με πάγο.
Η συμβατική και πιο συχνά εφαρμοσμένη είναι η μέθοδος της αργής κατάψυξης ωαρίων. Εδώ ο πάγος αναπτύσσεται πρώτα εξωτερικά και μετά εσωτερικά, καθώς η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας επιτρέπει τον ωσμωτικό έλεγχο μεταξύ του ενδοκυττάριου και εξωκυττάριου υγρού, διασφαλίζοντας ότι το ενδοκυτταρικό υγρό θα είναι σε μικρότερη συγκέντρωση από το εξωτερικό. Όμως, αν η ψύξη δεν γίνει με τον κατάλληλο ρυθμό, ενδέχεται το κύτταρο να αφυδατωθεί και να συρρικνωθεί, λόγω της υπερβολικής απώλειας ενδοκυτταρικού νερού.
Μια πιο σύγχρονη, γρήγορη και άμεση μέθοδος κρυοσυντήρησης είναι αυτή της υαλοποίησης, κατά στην οποία τα ωάρια βυθίζονται αμέσως μετά τη λήψη τους από τα ωοθυλάκια σε υγρό άζωτο στους -196ΟC παρουσία κρυοπροστατευτικών ουσιών, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός συμπαγούς κυττάρου, που μοιάζει με γυαλί. Μία πιο επιστημονική προσέγγιση θα έλεγε ότι το νερό κατά τη βύθιση στο υγρό άζωτο υπερψύχεται και μετατρέπεται σε άμορφο στερεό, δηλαδή σε ένα στερεό-υγρό, το οποίο επιτυγχάνεται σε συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασίας. Πάλι αν οι ρυθμοί ψύξης δεν είναι τόσο γρήγοροι, υπάρχει κίνδυνος σχηματισμού πάγου.
Μέχρι στιγμής, περιγράφηκαν τα βήματα διέγερσης των ωοθυλακίων, λήψης ωαρίων και κρυοσυντήρησης. Τι γίνεται σε περίπτωση που τα ωάρια αυτά πρέπει να χρησιμοποιηθούν για τεκνοποίηση; Υποβάλλονται σε διαδικασία απόψυξης με θέρμανση, αλλά ακόμα και σε αυτήν τη φάση υπάρχει κίνδυνος σχηματισμού πάγου. Υπάρχει ένα φαινόμενο που ονομάζεται ανακρυστάλλωση, κατά το οποίο οι κρύσταλλοι του άμορφου στερεού, που σχηματίστηκαν κατά την ψύξη, μεγαλώνουν σε μέγεθος. Αυτό μπορεί να προκαλέσει βλάβες και τραυματισμό στα κύτταρα. Μάλιστα, έχει παρατηρηθεί ότι όσο μικρότερος είναι ο ρυθμός θέρμανσης, τόσο πιο πιθανή η δημιουργία πάγου και άρα μεγαλύτερη η πιθανότητα για βλάβη. Έτσι, προτιμάται σχετικά αυξημένος ρυθμός θέρμανσης.
Το τελικό βήμα για την πλήρη απόψυξη είναι η απομάκρυνση των κρυοπροστατευτικών. Τα βήματα εδώ είναι αντίθετα από αυτά που ακολουθήθηκαν για την είσοδο των κρυοπροστατευτικών στο κύτταρο. Σε αδρές γραμμές, αναγκάζεται το κύτταρο να λάβει νερό και να διογκωθεί, με αποτέλεσμα η διαφορά συγκέντρωσης να ωθεί το κρυοπροστατευτικό στο εξωτερικό του κυττάρου.
Αν οι παραπάνω διαδικασίες ολοκληρώθηκαν με επιτυχία και οι ωοθηκικοί ιστοί και τα ωάρια είναι σε αξιοποιήσιμη κατάσταση, τότε μπορεί να προχωρήσει η γονιμοποίηση. Στο σημείο αυτό υπάρχουν δύο επιλογές, για να πραγματοποιηθεί η γονιμοποίηση είτε φυσιολογικά είτε με εξωσωματική. Όμως, επειδή κατά την απόψυξη υπάρχει κίνδυνος να έχει επηρεαστεί η εξωτερική μεμβράνη του ωαρίου (γνωστή αλλιώς ως διάφανης ζώνη), αποτρέποντας την είσοδο του σπερματοζωαρίου σε αυτό, συνήθως επιλέγεται ο δρόμος της εξωσωματικής. Μάλιστα, για να μεγιστοποιηθούν οι πιθανότητες επιτυχίας, προτιμάται όχι η συνηθισμένη IVF, όπου το ωάριο έρχεται σε επαφή με πολλά σπερματοζωάρια μέχρι κάποιο από αυτά να το διαπεράσει, αλλά η μέθοδος της μικρογονιμοποίησης, κατά την οποία το σπέρμα εγχέεται απευθείας στο ωάριο με βελόνα.
ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΠΗΓΕΣ
- Ovarian Tissue Freezing (Cryopreservation), hopkinsmedicine.org. Διαθέσιμο εδώ
- Cryopreservation of Human Ovarian Tissue: A Review, PubMed. Διαθέσιμο εδώ
- Techniques of Cryopreservation for Ovarian Tissue and Whole Ovary, PubMed. Διαθέσιμο εδώ
- Stepped vitrification technique for human ovarian tissue cryopreservation, nature.com Διαθέσιμο εδώ
